Raziskave

Odkrivanje novih regulatorjev izražanja RANKL, ključne molekule ne samo v kostni prenovi

Šifra:

J3-7245

Obdobje:

01. januar 2016 - 31. december 2018

Obseg:

1,88 FTE

Vodja:

Janja Marc

Veda:

3.07 Medicina/Metabolne in hormonske motnje

Opis:

Ligand za receptor aktivatorja jedrnega dejavnika-κB (RANKL) je del sistema RANKL/RANK/ OPG, ki igra ključno vlogo v kostni resorpciji in več drugih fizioloških procesih. Porušeno uravnavanje RANKL je vpleteno v razvoj osteoporoze (OP), osteoartroze (OA), avtoimunskih bolezni, kroničnih vnetnih bolezni in različnih vrst raka, kar je vodilo do uvedbe denosumaba, monoklonskega protitelesa proti RANKL, v klinično prakso za zdravljenje OP in preprečevanje kostnih zapletov pri bolnikih z metastazami. Medtem, ko je razumevanje posledic aktivacije RANKL razmeroma dobro poznano, pa je presenetljivo malo znanega o stimulusih in molekularnih poteh, ki uravnavajo izražanje samega RANKL. Večina informacij o transkripcijskem uravnavanju izražanja RANKL izhaja iz študij mišjih osteoblastnih/stromalnih celic, medtem ko so podatki o uravnavanju RANKL v človeških celicah izjemno skopi. Dosedanje študije tako kažejo na pomen distalnih ojačevalcev in proksimalnega promotorja, ki lahko sodelujeta preko nepoznanih mehanizmov. Rezultatov študij uravnavanja na mišjih modelih ne moremo neposredno prenesti na človeka, saj se regulatorni elementi razlikujejo med vrstami, prav tako pa lahko tudi med različnimi tipi celic, kar kaže na nujnost nadaljnjih študij uravnavanja gena za človeški RANKL v različnih tipih celic. RANKL nedvomno igra pomembno vlogo pri pogostih degenerativnih boleznih kosti in sklepov kot sta OP in OA, ter tudi pri pljučnem raku, ki predstavlja vodilni vzrok smrti zaradi rakavih obolenj. Kljub temu je transkripcijsko uravnavanje RANKL v humanih osteoblastih, hondrocitih ali rakavih celic pljuč slabo, oziroma sploh še neproučeno. Glavni cilj projekta IREGULAR – Identifikacija novih regulatorjev RANKL, je zato identifikacija transkripcijskih regulatorjev izražanja RANKL v območju proksimalnega promotorja v humanih osteoblastih, hondrocitih in rakavih celicah pljuč. Nadalje želimo ovrednotiti interakcije identificiranih transkripcijskih dejavnikov (TF) z enoverižno DNA, z namenom razumevanja dinamike vezavnega procesa DNA-TF. Za dosego teh ciljev bomo oblikovali 4 poročevalske plazmide z različno dolgimi odseki promotorja RANKL, ki bodo pokrili območje 900 bp od mesta začetka transkripcije. Vpliv vsakega plazmida na transkripcijo RANKL v človeških hondrocitih, celičnih linijah nedrobnoceličnega raka pljuč z različnim metastatskim potencialom in različno diferenciranih osteoblastnih linijah, bomo vrednotili z merjenjem luciferazne aktivnosti. S pomočjo bioinformatike in mestno specifične mutageneze bomo določili natančna vezavna mesta TF, dejansko vezavo specifičnih TF pa potrdili s testom zamika elektroforezne mobilnosti. Rezultate in vitro dela bomo v nadaljevanju nadgradili z merjenjem TF v humanih kostnih vzorcih bolnikov z OP ali OA oziroma zdravih kontrol z imunohistokemijo in kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času. Dodatno bomo z uporabo nuklearne magnetne resonance (NMR) in ostalih komplementarnih spektroskopskih metod pridobili informacije o potencialnih sekundarnih strukturah promotorja RANKL in vpogled v interakcije DNA-TF na molekularnem nivoju. Identifikacija novih TF, vključenih v uravnavanje transkripcije RANKL, bo pomembno pripomogla k razumevanju poti, ki vodijo v porušeno uravnavanje RANKL pri različnih boleznih kot so OP, OA in pljučni rak. Ti TF in njim nadrejeni dejavniki predstavljajo potencialne biološke označevalce aktivnosti RANKL in/ali učinkovitosti zdravljenja z denosumabom ter nove tarče zdravil. Pojasnitev celično specifičnega uravnavanja izražanja RANKL bo lahko prispevala k bolj usmerjenim načinom zdravljenja z zmanjšanimi neželenimi učinki v netarčnih tkivih. Rezultati spektroskopskih študij pa bodo lahko prispevali k razvoju aptamernih zdravil oziroma diagnostikov.

Faze:

https://cris.cobiss.net/ecris/si/en/project/10058

Bibliografske reference, ki izhajajo neposredno iz izvajanja projekta:

https://cris.cobiss.net/ecris/si/en/project/10058

Financira:

Raziskovalni projekti so (so)financirani s strani Javne agencije za raziskovalno dejavnost.

Nazaj

Spremenjeno: 14. junij 2016