logo_si

Preprečevanje rezistence tumorskih celic na antiproteazno terapijo z inhibitorji katepsina X

Šifra:

J4-8227

Obdobje:

30. april 2017 - 30. april 2020

Obseg:

1,41 FTE

Vodja:

Prof. dr. Janko Kos

Veda:

4.06.01 Biotehnika/Biotehnologija/Tehnologija rekombinantne DNA

Sodelujoče RO:

http://www.sicris.si/public/jqm/prj.aspx?lang=slv&opdescr=search&opt=2&subopt=403&code1=cmn&code2=auto&psize=1&hits=1&page=1&count=&search_term=fakulteta%20za%20farmacijo&id=12506&slng=&order_by=

Sestava projektne skupine:

http://www.sicris.si/public/jqm/prj.aspx?lang=slv&opdescr=search&opt=2&subopt=402&code1=cmn&code2=auto&psize=1&hits=1&page=1&count=&search_term=fakulteta%20za%20farmacijo&id=12506&slng=&order_by=

Bibliografske reference:

http://www.sicris.si/public/jqm/prj.aspx?lang=slv&opdescr=search&opt=2&subopt=400&code1=cmn&code2=auto&psize=1&hits=1&page=1&count=&search_term=fakulteta%20za%20farmacijo&id=12506&slng=&order_by=

Vsebina:

http://www.sicris.si/public/jqm/prj.aspx?lang=slv&opdescr=search&opt=2&subopt=405&code1=cmn&code2=auto&psize=1&hits=1&page=1&count=&search_term=fakulteta%20za%20farmacijo&id=12506&slng=&order_by=

Opis:

Napredovanje malignih bolezni je povezano s prekomernim delovanjem proteoliznih encimov. Ti so udeleženi v vrsti procesov, ki omogočajo rast tumorjev, njihovo ožiljanje, migracijo in invazijo tumorskih celic in tvorbo metastaz. Med ključne proteolizne encime, povezane z malignimi procesi, sodijo cisteinski katepsini, ki se v normalnih celicah nahajajo predvsem v endosomih in lizosomih in so odgovorni za znotrajcelični katabolizem proteinov. V tumorskih celicah pa se katepsini prenesejo na celične membrane ali izločajo iz celic ter vstopajo v tumorsko proteolizno kaskado.  Kot najpomembnejši tumorski promotor se je izkazal katepsin B, ki v lizosomih deluje predvsem kot eksopeptidaza in je udeležen v normalnem proteinskem katabolizmu in avtofagiji, v tumorskem okolju pa katepsin B močno poveča endopeptidazno aktivnost, ki je odgovorna za razgradnjo zunajceličnega matriksa. Do te spremembe pride zaradi konformacijskega preklopa, ki je posledica fleksibilne strukturne enote, imenovane zaporna zanka, ki regulira vstop proteinskih substratov v aktivno mesto. Katepsin B je nadizražen v praktično vseh vrstah tumorjev, inhibicija njegovega izražanja ali pa endopeptidazne proteolizne aktivnosti pa se kaže v bistveno zmanjšani tumorski rasti in metastaziranju. V zadnjem času je bila razvita vrsta specifičnih inhibitorjev katepsina B, ki so postali kandidati za klinična testiranja.  Žal se je izkazalo, da se s časom učinkovitost teh inhibitorjev zmanjša, saj tumorske celice razvijejo rezistenco napram terapiji, usmerjeni proti katepsinu B. Ugotovili smo, da je glavni dejavnik te rezistence katepsinu B podoben katepsin X. Tudi ta encim deluje kot karboksipeptidaza, v tumorjih pa ne razvije endopeptidazne aktivnosti in ne razgrajuje zunajceličnega matriksa, pospešuje pa tumorsko migracijo in invazijo z alternativnimi mehanizmi, predvsem preko regulacije integrinskih receptorjev in tumorskega supresorja profilina 1. Njegovo povečano izražanje in aktivnost sta torej povezani z obnovljeno sposobnostjo tumorskih celic da migrirajo in invadirajo, čeprav to pot brez razgradnje zunajceličnega matriksa.

Naša hipoteza je da lahko inhibitorji katepsina X bistveno zmanjšajo rezistenco tumorskih celic na antiproteazno terapijo, usmerjeno protu delovanju katepsina B. V ta namen nameravamo pripraviti inhibitorje katepsina X, ki bodo i) majhne molekule z reverzibilno in tesno vezavo, ii) selektivni za katepsin X, iii)  vodotopni in netoksični za sesalčje celice. Nove spojine bodo pripravljene s pomočjo strukturno podprtega načrtovanja zdravil, pri čemer bomo uporabili virtualno rešetanje knjižnic spojin, encimsko kinetiko in usmerjeno sintezo. Strukture z najboljšim prileganjem aktivnemu mestu katepsina X bodo sintetizirane, očiščene in okarakterizirane. Pripravili bomo tudi formulacije, ki bodo primerne za njihovo nadaljnje testiranje in vitro in in vivo. Spojine bomo testirali v in vitro modelih tumorske adhezije, migracije, invazije in angiogeneze, ki bodo posnemali patološke procese napredovanja raka, ki smo jih predhodno razvili v naših laboratorijih. Izbrane inhibitorje katepsina X bomo testirali in vivo na mišjih modelih tumorske rasti in metastaziranja, ki so bili razviti v naših laboratorijih za testiranje učinkovitosti inhibitorjev katepsina B in drugih cisteinskih proteaz. Tako bomo uporabili C57Bl/6 miši in LPB-1 tumorske celice v modelu mišjega fibrosarkoma in FVB/N miši in njihovo transgeno linijo FVB/PyMT v modelu raka dojk. Določili bomo tudi signalne poti, ki privedejo do aktivacije izražanja katepsina X ob pojavu tumorske rezistence in opredelili nove tarče, katerih regulacija bi lahko dodatno izboljšala antiproteazno terapijo pri pacientih z rakom.

Naš pristop predstavlja izviren način preprečevanja rezistence tumorskih celic na obstoječe protitumorske učinkovine, omogoča njihovo hitrejšo translacijo v klinična testiranja in bolj učinkovito zdravljenje bolnikov z rakom.

Faze:

V prvem letu izvajanja projekta smo dosegli sledeče rezultate pri doseganju posameznih ciljev:

Cilj 1: Razviti nove inhibitorje Kat X, ki bodo majhne molekule z reverzibilno in tesno vezavo, selektivni za Kat X, vodotopni in netoksični za sesalčje celice. 
Opravili smo vse specifične naloge, ki smo si jih zastavili pri tem cilju. Te naloge so bile: 1. Virtualno rešetanje knjižnic spojin za inhibitorje Kat X, 2: Sinteza ali pridobivanje najboljših zadetkov po virtualnem rešetanju, 3: Testiranje potencialnih inhibitorjev Kat X z merjenjem relativne inhibicije, 4: Testiranje potencialnih inhibitorjev Kat X z uporabo termoforeze.

Rezultat tega dela so bili novi reverzibilni in selektivni inhibitorji katepsina X s triazolno strukturo. Izmed množice trazol-benzodioksinskih derivatov je spojina 22 izkazovala najboljšo inhibicijo karboksipeptidazne aktivnosti katepsina B (Ki 2,45 uM) z vsaj 100 krat večjo selektiovnostjo v primerjavi s katepsinom B in drugimi cisteinskimi peptidazami. Spojina 22 tudi značilno inhibira migracijo tumorskih celic, ki je odvisna od prisotnosti katepsina B. Rezultate smo objavili v reviji Scientific Reports. (1)

Prav tako smo izboljšali že razvit inhibitor katepsina B nitroksolin, ki je v prejšnjih študijah izkazal učinkovito protitumorsko delovanje. Z uporabo strukturno podprte kemijske sinteze smo razvili vrsto novih derivatov. Izmed njih je  7-aminometiliran derivat (spojina 17) kazal močno izboljšane kinetične lastnosti v primerjavi z nitroksolinom. Bolje je zavrl tumorsko invazijo in migracijo, boljše od nitroksolina je tudi zaviral rast tumorjev in vivo na mišjem modelu fibrosarkoma. Nov inhibitor nam bo zelo koristil pri kombiniranih študijah inhibitorjev katepsinov X in B. (2) 

Cilj 2: Dokazati, da novi inhibitorji učinkovito zavirajo tumorsko rast, invazijo,migracijo in angiogenezo v in vitro testnih modelih, bodisi sami ali v kombinaciji z znanimi inhibitorji Kat B in drugih z rakom povezanih peptidaz.

V tem sklopu smo izvedli naslednje specifične naloge: 8:Preverjanje izražanja, proteinskih in aktivnostnih nivojev in lokalizacije Kat X v različnih tumorskih celicah, 9: Preverjanje citotoksičnosti inhibitorjev Kat X na tumorskih celicah, 10:Testiranje inhibitorjev Kat X posamezno ali v kombinaciji z inhibitorji Kat B v modelih tumorske adhezije, migracije in invazije v časovnih točkah 11:Testiranje inhibitorjev Kat X posamezno ali v kombinaciji z inhibitorji Kat B v modelih tumorske adhezije, migracije in invazije v realnem času.

Pri zadnji specifični nalogi smo izvedli le testiranja za posamezne inhibitorje, ne pa za kombinacije.  Rezultati so pričakovani in omogočajo nadalnja testiranja in vitro in in vivo. Delno so bili že vključeni v publikaciji 1 in 2 (1,2).

Cilj 3: Dokazati medsebojno povezanost Kat B in X pri raku in določitv signalizacijskih poti, ki vodijo do kompenzacijskega efekta pri anti-peptidazni protitumorski terapiji.

Pri tem cilju smo izvajali specifično nalogo 12: Določanje signalnih poti v tumorskih celicah z zmanjšanim ali povišanim izražanjem Kat B in /ali Kat X z mikromrežami. 

Preverili smo vpliv katepsinov X in B na signalizacijo preko TGF beta1 in z njim povezano aktivacijo epitelno mezenhimskega prehoda. Ugotovili smo, da je s to signalno potjo povezano delovanje katepsina B, manj pa katepsina X. (3)

1. PEČAR FONOVIĆ, Urša, MITROVIĆ, Ana, KNEZ, Damijan, JAKOŠ, Tanja, PIŠLAR, Anja, BRUS, Boris, DOLJAK, Bojan, STOJAN, Jure, ŽAKELJ, Simon, TRONTELJ, Jurij, GOBEC, Stanislav, KOS, Janko. Identification and characterization of the novel reversible and selective cathepsin X inhibitors. Scientific reports, ISSN 2045-2322, 2017, vol. 7, , str. 1-11 [COBISS.SI-ID 4382065]
2. MITROVIĆ, Ana, SOSIČ, Izidor, KOS, Špela, LAMPREHT TRATAR, Urša, BREZNIK, Barbara, KRANJC, Simona, MIRKOVIĆ, Bojana, GOBEC, Stanislav, LAH TURNŠEK, Tamara, ČEMAŽAR, Maja, SERŠA, Gregor, KOS, Janko. Addition of 2-(ethylamino)acetonitrile group to nitroxoline results in significantly improved anti-tumor activity in vitro and in vivo. Oncotarget, ISSN 1949-2553, 2017, vol. 8, no. 35, str. 59136-59147 [COBISS.SI-ID 4360305]
3. MITROVIĆ, Ana, PEČAR FONOVIĆ, Urša, KOS, Janko. Cysteine cathepsins B and X promote epithelial-mesenchymal transition of tumor cells. European journal of cell biology, ISSN 0171-9335, 2017, vol. 96, iss. 6, str. 622-631, [COBISS.SI-ID 4323185]

Sodelujoče RO:

http://www.sicris.si/public/jqm/prj.aspx?lang=slv&opdescr=search&opt=2&subopt=403&code1=cmn&code2=auto&psize=1&hits=1&page=1&count=&id=12506&slng=&search_term=fakulteta+za+farmacijo&order_by=

Sestava projektne skupine:

http://www.sicris.si/public/jqm/prj.aspx?lang=slv&opdescr=search&opt=2&subopt=402&code1=cmn&code2=auto&psize=1&hits=1&page=1&count=&id=12506&slng=&search_term=fakulteta+za+farmacijo&order_by=

Vsebina:

Bibliografske reference, ki izhajajo neposredno iz izvajanja projekta:

http://www.sicris.si/public/jqm/rsr.aspx?lang=slv&opdescr=search&opt=2&subopt=300&code1=cmn&code2=auto&psize=1&hits=1&page=1&count=&search_term=fakulteta%20za%20farmacijo&id=5204&slng=&order_by=



Raziskovalni projekti so (so)financirana s strani Javne agencije za raziskovalno dejavnost.

Financira: